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實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

2022-09-17 17:02:22

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)概念

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR),又名定量PCR,是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。它通過(guò)內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理

它的原理是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程,通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)

a.可進(jìn)行準確的定量檢測,實(shí)時(shí)性和準確性好;

b.定量范圍寬;

c.靈敏度高;

d.特異性和可靠性更強,克服了假陽(yáng)性;

e.操作簡(jiǎn)單快速,無(wú) 污染,無(wú)須后處理和電泳檢測;

f.安 全,技術(shù)易于學(xué)習,易于進(jìn)行電腦化數據管理;

g.目前已廣泛應用于分子生物學(xué)研究和醫學(xué)研究等領(lǐng)域。

PCR反應基本步驟

a.變性:通過(guò)加熱使模板DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂,雙鏈分開(kāi)而成單鏈的過(guò)程,高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈(94℃,30s)。

b.退火:當溫度降低時(shí),引物與模板DNA中互補區域結合成雜交分子,低溫下,引物與模板DNA互補區結合(55℃,30s)。

c.延伸:在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈,中溫延伸,DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(70-72℃,30-60s)。

以上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)的模板,經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后,目的DNA以2n的形式增加。


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